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最新！猴痘抗原EUA通道昨日开启，template深度解读来了！

千呼万唤之下，在美国时间11月29日，猴痘抗原EUA template终于出台了。虽然这个时间点有些许尴尬，因为目前全球范围内，以及美国境内的猴痘新增人数急剧下降，很多厂家都已经对猴痘试剂的开发望而却步了。但是该template的发布，使得之前传闻所说的“30天关闭猴痘EUA通道”不攻自破。


现在普瑞君更有底气断言，您的产品被EUA拒绝并不是因为猴痘检测EUA通道关闭了，而是因为该产品不是FDA感兴趣的类型，至于什么是FDA感兴趣的产品，请看往期解读。


CDC公布的美国猴痘疫情情况


分析性能

关于大家都很关心的猴痘抗原EUA分析性能，需要注意以下几点：

  • 建议使用定量的活病毒和灭活病毒作为抗原检测的阳性样品；

  • EUA明确指出尽量不要使用VTM作为拭子的运输介质，因为FDA发现不同牌子的VTM会使猴痘抗原产品出现交叉反应。但是FDA依然保留了VTM/UTM这个选项。并建议如果猴痘抗原试剂盒是采用VTM作为运输介质，那么，swab应该蘸取阳性样品，然后浸润到VTM中去进行分析研究。

  • 如果猴痘抗原试剂盒不涉及VTM的步骤，那么稀释到VTM中的临床基质也不适合作为此类试剂盒的临床基质使用。

  • 分析研究中，FDA建议使用定量的灭活/活病毒添加到天然的临床基质中进行试验，并且不推荐使用重组蛋白。

  • FDA认为不包含临床样品/临床基质的运输介质/取样试剂不能作为真正的临床基质。

  • 如果标本采集涉及使用拭子，建议您将病毒材料加入到拭子上，然后按照使用说明进行检测。


检出限：
  • 方案与PCR的相差不大：先对阳性样品以2-3倍系列稀释，每个浓度进行3个重复的检测；确定100%的检出的最低的阳性样品浓度作为初始LoD，然后使用该LoD的浓度进行20次重复，来确定最终的LoD结果。

包容性研究：
  • 删减了对猴痘分离株的建议；
  • 需要制定监测猴痘病毒变异株的计划。

交叉反应研究
  • 明确建议每个病原体需进行三个重复；
  • 建议湿法检测33个相关病原体和人类DNA的交叉反应；
  • 明确了病原体的浓度范围（细菌>=106 CFU/mL；病毒>=105 pfu/mL或TCID50）；
  • FDA建议如果部分病原体难以获取，那么需要咨询FDA以及做生物信息学分析。

微生物干扰研究
  • 明确建议三个重复；
  • 明确建议阳性病毒浓度在2-3×LoD；
  • 明确了病原体的浓度范围（细菌>=106 CFU/mL；病毒>=105 pfu/mL或TCID50）；
  • 若涉及多个临床基质，则应在最具挑战性的临床基质中进行研究；
  • 若在EUA建议的测试水平下观察到干扰，则应进行额外的滴定研究以确定您的测试可以容忍的最高微生物干扰水平。

内外源干扰
  • 在存在或不存在灭活猴痘病毒的情况下进行干扰研究；
  • 明确建议三个重复；
  • 明确建议阳性病毒浓度在2-3×LoD；
  • 与PCR一样的内外源物质。

生物素干扰
  • 若试剂中用了生物素系统则需要进行试验；
  • 生物素浓度建议大于3500 ng/mL；
  • 存在或不存在灭活猴痘病毒（2-3×LoD）的情况下进行干扰研究。

勾状效应
  • FDA建议增加病毒浓度来检测是否出现勾状效应。

样本稳定性
  • 跟PCR的总体建议相似，对新鲜制备的3倍LoD的阳性样品进行室温2小时的样本稳定性评估；
  • 若需要对冷冻的临床样品进行检测，则需要在等效性研究中评估新鲜和冷冻样品对性能评估的差异；
  • 试剂稳定性，可仅提供方案。

VTM/UTM的等效性
  • 若使用VTM/UTM作为运输介质，需在EUA申请中的预期用途中列出临床和分析研究中使用的每个品牌的运输介质；
  • 建议对每种VTM/UTM进行3个批次的产品的检验，每个批次需要进行2×LoD阳性样品5个重复，5×LoD的阳性样品5个重复，阴性样品10个重复；
  • 如果阴性样品出现交叉反应，那么重复数可能需要增加。

临床试验

接着和大家说说临床方面的情况。

首先，这次发布的猴痘抗原Template中没有关于self test产品的要求。合理推测为什么没有self test产品的要求，可能是因为FDA也认为猴痘这种表征性明显的疾病做self test意义不大，并且在取样过程中可能出现刺破水泡的情况，会有导致患者感染的风险。

其次，该版本的Template针对的适应症是疑似感染猴痘患者，而不像新冠抗原那样，适应症除了有疑似感染患者外，还有无症状筛查。估计还是和猴痘感染不存在无症状确诊者有关。

指导意见

该版本的Template给到的主要指导意见如下：

  • 临床评估至少需要30+30-，要求是前瞻性临床试验，如果一开始是采用了回溯性临床样本的话，在EUA授权后还是要补充前瞻性临床。与猴痘核酸试剂不一样的是：抗原不接受人造样本的性能验证，切记切记！

  • FDA在template中写得很详细：要有伦理和知情同意信息，这就意味着当前哪怕厂家找到猴痘的回溯性临床样本，也未必能适用。（关于这点，普瑞纯证团队正着手和FDA进行沟通。众所周知当前全球猴痘病例急剧下降，开展前瞻的周期是非常长的，而要进行回溯性研究，当前能找到的大部分都是只有伦理没有知情的临床样本，对于指南的知情同意内容如何解读，普瑞纯证团队也需要咨询FDA态度）。

  • 如果是采用回溯的临床样本，需要使用盲法，并且弱阳性样本要占总体样本数的12%-20%。因为FDA认为这样才符合临床真实情况下的病毒载量在人群中的自然分布。关于弱阳性的定义是：参考试剂LOD所对应的CT值±3的病毒浓度样本。

  • FDA建议入组的受试者信息写上出现症状的天数，这个要求和新冠产品的要求一样，但是这点在现实中实现的难度较大。目前能找到的回溯性临床样本都不具备这个信息，这就意味着基本上是要进行前瞻性临床试验。

  • 关于需要连续检测的试剂盒，Template中用了serial testing这个词，意味着需要设计相关的临床试验，证明自己说明书的宣称是合理有效的。具体怎么理解呢？在新冠抗原的产品中，会写着如果怀疑自己被感染，在第一次检测结果是阴性后，需要在24小时/48小时内再次检测。对于类似以上情况的低灵敏度猴痘抗原产品，在临床试验上，都要有充足的证据证明再次检测的结果的有效性以及设计连续检测时间周期的合理性。

  • 关于POCT产品，还有特殊的针对operator的要求：需要操作者是在非实验室、CLIA豁免的site进行（例子包括医生诊所、急救室等），参与人员也不能是医生护士，但必须是healthcare provider，并且不能有太丰富的实验技能经历（普瑞君理解大概是职业药师之类的角色）。然后产品介绍使用培训的材料也必须有限制，只能看快速使用手册，或者视频，或者手机提示。CLIA实验室好找，非CLIA实验室也好找，但是非CLIA实验室还能检测猴痘临床样本的地方，就真的有点不好找了。不过这也更加衬托进行该项试验是多么高要求了。

以上是猴痘抗原EUA的template的深入解读了，最后也说说我们普瑞纯证的优势在哪里：

对于分析性能验证，我们与多家可进行分析性能试验的实验室合作，并能提供活病毒及灭活病毒的样品材料（绝非重组蛋白）进行分析性能的验证，确保猴痘抗原EUA的分析性能项目顺利进行。

此外，猴痘病毒也许还算容易找的，但是最难找的是临床阴性基质，与新冠已经有人造的鼻咽临床阴性基质不一样，猴痘的临床阴性基质只能找出疹性的非猴痘皮肤病患者才能获得，例如带状疱疹、天花等，非常难入组。而这点，普瑞纯证早就已经布局多时了，甚至还收样了猴痘疫情爆发前的皮肤病临床阴性基质。目前相关的猴痘阴阳性样本库存情况，欢迎大家浏览我们我GRIP平台：https://grip.purefda.com，在【生物样本中心】获得最快最全的生物样本资讯。

关于之前EUA获批的雅培与QUEST猴痘核酸试剂，是不能作为参考试剂的，FDA在Town Hall会议上也说得很明确，因为这两款试剂都是采用人造样本完成的性能验证，而不是使用真实临床样本，所以是不能作为参考试剂的。目前在市面上，除了CDC猴痘试剂外，唯一适合作为参考试剂的就是罗氏的EUA猴痘试剂，而该款试剂试剂还未在美国市场上流通，属于有价无市的状态。而普瑞纯证，除了拥有CDC设计的猴痘引物探针试剂外，已经直接联系了罗氏供应商，正在采购罗氏试剂了，近日将会到货。

普瑞纯证一直在进行全美猴痘前瞻性临床资源的规划布局，现在基本上已经和全美各大传染病检测中心谈妥战略合作关系，可以随时开展前瞻性临床试验。

机不可失，失不再来，稀缺的资源是不会等人的，普瑞纯证欢迎您的垂询~




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