自英格兰公共卫生部（PHE）发布关于新冠病毒高关注变异株（VOC）的第一次报告以来，MHRA（英国药品和医疗器械监管机构）已经意识到对于新冠病毒变种的诊断检测出现了越来越多有关其结果有效性的担忧。最近，MHRA对相关制造商指南文件进行了更新。普瑞君今天特别为大家带来了这份非常详尽的制造商指南全文！技术长文，欢迎阅读。自2020年12月以来，随着英格兰公共卫生部（PHE）在12月11日发布了第一份关于新冠病毒高关注变异株（VOC）的报告，MHRA已经意识到对于新冠病毒变种的诊断检测出现了越来越多有关其结果有效性的担忧。新冠病毒检测的诊断分析对于疫情管控至关重要。但是，由于诊断检测靶向基因序列，不同病毒菌株可能会影响到检测的结果。任何影响的性质和严重程度取决于检测的过程，但在最坏情况下，可能会导致假阴性结果。计算机序列监测可以减轻此问题的影响。MHRA正与外部伙伴合作，密切关注这一问题。一个VOC认证工作组已被成立来为新冠体外检测（IVD）结果提供担保框架。工作组包含MHRA以及来自英国卫生安全局（UKHSA）、英格兰国家医疗服务系统（NHS England）、医疗服务提升与发展中心（NHS Improvement）的专家和来自四个地区政府的成员。MHRA会定期与英国的检测产品供应商与制造商制造接洽，以检查检测产品进入市场前的认证流程来应对在英国传播的最新发布的变种病毒。MHRA已经提醒了制造商们，当新型变种被确认时，他们有义务监测并认证其检测试剂仍有效。这是一项此前MHRA已向英国市场内新冠体外诊断试剂制造商们要求的承诺。出于对奥密克戎变种（B.1.1.529）的担忧，制造商与供应商们已被要求立刻告知MHRA对于他们检测试剂表现的评估。如果基于已知信息，制造商的检测试剂被怀疑或存在检测效能问题的风险，那么MHRA会按需要求该制造商提供额外信息或进行额外测试。由于新冠病毒基因序列的多样性，诊断检测的设计与监控都需要以一种主动的方式来实时监测病原体的进化。这能够识别并重新设计那些可能受到变种影响的诊断检测，从而避免假阴性结果对新冠感染者管理的潜在影响。只要制造商的检测试剂仍然在英国市场上出售，制造商们就需要对他们检测试剂的安全性和有效性负责。 为帮助制造商履行这一责任，MHRA提醒制造商们制定一个产品上市后监控方案（PMSP）以持续监测、调查并评估新出现的新冠变种病毒对于诊断检测效果的影响。根据2002年英国医疗器械法规，MHRA认定与新冠变种病毒相关的报告是严重的公共健康威胁，因此显著的安全问题（例如，检测性能下降）应当在48小时内被报告。使用可用的新冠基因序列数据来监测检测的有效性将会为临床社区以及那些负责管理新冠疫情任务的人员提供先见之明，从而在面对病毒基因组进化时避免诊断检测失败。1. 厂商应当告知MHRA新识别的新冠变种病毒对每个引物/探针/其他寡核苷酸靶序列和检测效能的影响的初始风险评估结果。已识别的新冠病毒列表可在英国公共卫生网站上的“Investigation of novel SARS-CoV-2 Variants of Concern”找到。
2. 每月应提交一份更新报告给MHRA。报告中需要包括的信息有：
a) 关于诊断检测中任何基因靶向目标的敏感性是否被任何一种新冠变种病毒所影响的信息。b) 以下两种信息的其中一份：所有在分析中使用的基因序列的序列编号（例如，COG-UK ID或Accession），或者充足的元数据（例如，周/日时间范围下的遗传谱系）和用来确保所使用的数据在需要的情况下可以被独立地检索识别的基因序列选择标准。
与GISAID发布的所有新冠变种病毒相关，正在进行的必要上市后监管活动：
- 每两周一次，电脑检查检测靶向目标与GISAID序列数据库中的对比情况。(https://www.gisaid.org/)（*注意引人注目的潜在问题应当立刻被调查）
- 向MHRA报告任何临床上重要的新冠变种病毒对检测所导致的潜在安全问题。
1. 厂商们应当使用GISAID网站 (https://www.gisaid.org/) 上的可用信息来监控新冠变种病毒的出现，并在检测的目标抗原出现>100的基因序列改变时重新检查变种病毒的检测方案。这应当每两周进行一次，除非MHRA通知他们出现新的高关注变异株并且需要立刻加以注意。
2. 作为定期监测的一部分，如果变异菌株在靶向抗原中被发现出现了氨基酸的改变并且可能会影响检测的有效性，那么这应优先在两天内被传达给MHRA。
3. 每月应提交一份更新的报告给MHRA。证据应当基于与抗体结合位点相比，具有氨基酸变化的靶抗原结构的计算机模拟，并以湿实验结果作为支撑。湿实验的结果应当与下列的其中之一或更多进行对比：
无论是有利的还是不有利的数据都应当报告给MHRA，作为对较好或较差表现的担保。如果你的检测性能被这些新型变种病毒直接影响，应立即发布一份产品安全通告（FSN）以警示消费者。更多的关于有效FSN的指南可以在这里被找到（Effective field safety notices (FSNs): guidance for manufacturers of medical devices - GOV.UK (www.gov.uk)）。
为此，我们为分子和/或抗原检测（包括侧流检测）的厂商们制定了具体指南：
所有直接检测病原体的体外诊断（IVD）解决方案（比如分别以蛋白质或RNA为靶的抗原或者分子检测）都应当在定期测试评估中监测重要变种病毒（定义为拥有一种或多种使其不同于参考序列的突变的病原体）所带来的影响并确保在第一次确认检测效果时特定的表现仍然能够保持。
理想情况下，这应该通过真实的临床案例来实证，但由于包含VOC的样例并不总是可获得，临床验证可能并不总是可行。此外，培养的有机体或者合成的分子也可能被用于探索VOC检测性能的潜在影响。IVD检测厂商应考虑测试开发和验证阶段所有相关的VOC以及未来基因变种的潜在影响。由于分子诊断检测手段直接靶向针对基因序列，因此任何变化都有干扰检测性能的可能性。这一问题可以通过计算机序列评估的方式缓解。然而，这一方法需要两条信息：尽管基于抗原的检测手段并不直接靶向针对基因序列，但相关基因区域内的非同义突变能够对检测表现造成不利且不可预测的影响，因此仍然推荐进行积极和持续的计算机监测。这些建议旨在指导在英国国内提供经授权的IVD检测的厂商们，但它们也同样用于提升那些IVD检测手段开发者们对计算机模拟监测的认识，并可能会酌情进行重新评估和校订。进行计算机模拟分析的频次十分重要，但该频次取决于IVD检测所靶向针对的基因区域发生突变的频率。首次测试确认必须考虑目标基因区域内的所有序列变异，并且针对特定目标量身定制上市后的计算机监控。
应当根据适合所讨论的病原体的频率进行持续的科学文献综述，以识别可能影响检测目标突变频率的任何新序列变体或者病原体大爆发时期。MHRA可能能够为特定的频次要求提供一些指导建议，但下面提供了广泛类别的指导：快速进化的目标。对于突变速度快或是在人群中爆发的目标，例如大流行的新型冠状病毒，应每月进行一次计算机分析。根据英国公共卫生部的指示，在发布与特定VOC、正在调查的变体（VUI）或者菌株有关的新信息时，可能需要增加频次或单独分析（例如，在收到来自技术简报中 “SARS-CoV-2 variants of concern and variants under investigation in England” 的信息后）。理想情况下，使用自动化分析过程以及数据库监测能够保证这个流程在新序列出现时近乎实时运行。
中等进化的目标。对于中等稳定的目标病原体基因区域（例如已知突变速率的已确定细菌和病毒病原体），分析的频率可以降低为每半年一次或每年一次。
高度保守的目标。高度保守或稳定的目标病原体遗传区域可能仅需要不那么频繁的监测（频次低于每年一次）或是不需要定期监测，只在从文献或是其他外部来源收到新信息时才进行分析。
对于用来与所查询序列做对比的核苷酸数据库，需要考虑的因素包括序列的质量，多样性以及数据在检测手段使用期间是否在英国国内具有代表性。序列的质量尤其重要，并且应当格外关注指定使用数据库中可用的高质量序列，以用来减少比对序列中的未知或模糊的碱基。
理想情况下，该数据库应包含可用于目标序列的所有高质量核苷酸记录，但是这可能并非在所有情况下都是可能的。在这些情况下，必须特别注意确保数据代表整体多样性。对于用于创建核苷酸数据库的序列源，所有使用的基因序列的序列标识符（例如登录代码或者COG-UK IDs）或者足量的元数据（例如周/日时间范围下的遗传谱系），以及用来保证所使用的数据在需要时可以被独立检索的序列选择标准，都应当被记录并在被要求时，提供给MHRA。基因序列分析应当由一位训练有素的生物信息学家或是具有操作大容量数据库经验的人来进行，所使用的工具应当经同行评审和版本控制。
所有工具和软件的版本信息和参考每次分析时都应当被记录下来以便检查。并且不鼓励在分析之间使用不同的工具或是不同版本的软件，除非已经进行了足够的认证和质量保证。为此，建议使用Docker或Singularity等服务对所使用的生物信息学管道或工具进行容器化。厂商或者参与到生物信息分析中的第三方应当确保用于电脑模拟分析所写的代码遵循了最佳的编程规范，要求包括代码可读且便于维护。为定期监测目标基因序列，我们建议从目标核苷酸序列的相关区域对应的完整记录中提取短序列，以减少非特异性序列比对，并使得目标区域得到更精确的质量控制。应当从数据库中移除目标区域内任何包含未知或模糊碱基的序列，来防止错误识别突变。在这些提取的基因序列中，应进行多数列比对（MSA）或局部比对来辨认目标基因序列中的突变（SNPs/SNVs，缺失或是插入），可使用经同行评审的工具如EMBL-EBI提供的Clustal Omega（可通过命令行或作为在线工具使用：https://www.ebi.ac.uk/）或者NIH提供的nucleotide BLAST®（可通过命令行或在线使用https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。如使用Clustal Omega，则检测序列可以被添加至一个multi-fasta数据库中并执行MSA，并在返回的数据中进行突变确认。但是，如果使用nucleotide BLAST®，则需要在运行分析和解析结果时多加注意，确保检测序列是作为“查询（Query）”被输入的，并在分析结果时考虑一致度和覆盖性。所有检测目标序列中的突变频率和位置都应该被记录；为了定期监控序列，也应当要计算基于分析的目标序列的百分比频率（例如，单独的SNP/SNV应该被记录为：C21026T，4.5% 频率）。对于分子检测手段，可以进行进一步的计算机分析，包括用检测引物或探针和测定靶序列来计算解链温度（Tm）。我们推荐将检测的所有情况都考虑进计算中（例如离子浓度和引物过量），以便最好地反映检测的真实情况。基于预测的基因序列突变对检测效能的影响，计算机分析应作为优先进一步调查的方法。我们强烈推荐进行更进一步的体外或是“湿”实验来验证这些预测。对于分子检测来说，任何经计算机分析确认的导致检测目标基因区域内出现错配并可能影响IVD检测表现的突变，都应当通过合成结构的体外或“湿”实验或是包含已知突变的分离物进行评估。突变对基于抗原的IVD检测的影响并不如对分子检测那样明显，因此若确认到任何在基因序列中发生的非同义突变，都应当通过湿实验进行评估。普瑞君说，希望这份MHRA官方的制造商指南能够为新冠检测试剂的制造商伙伴们带来一些帮助。欢迎持续关注PureFDA，带你领略前沿医疗法规信息的世界。Guidancefor manufacturers: diagnostic assurance with SARS-CoV-2 variants in circulation- GOV.UK (www.gov.uk)
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